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在我活着的时间里,将不会实现心肌肌钙蛋白I检测的标准化

2017-09-05  来源:冯仁丰微信号    编辑:李大人
导读
这篇文章发表在5年前、这是著名心脏病专家Dr Fred Apple写的。其实在当时,Dr Apple就注意到,仅仅依靠一个NIST公布的心肌肌钙蛋白标准物质SRM 2921,IFCC的cTnI标准化工作组期望实现标准化是不可…
注:这篇文章发表在5年前、这是著名心脏病专家Dr Fred Apple写的。其实在当时,Dr Apple就注意到,仅仅依靠一个NIST公布的心肌肌钙蛋白标准物质SRM 2921,IFCC的cTnI标准化工作组期望实现标准化是不可能的。因为在当时已经发现了心肌梗死的患者血液中有各个被解离的碎片。他指出,我们还没有弄清楚,在心肌梗死过程中血液中的被心脏细胞释放的肌钙蛋白的病理生理过程还不了解的前提下,不可能实现标准化。现在看来非常有实际意义。因此,我将他的文章再次在微信上发布。给大家有一个较全面的了解。
冯仁丰

201708

“在我活着的时间里,将不会实现心肌肌钙蛋白I检测的标准化”

Fred S. Apple

我已经选择了强调为什么心肌肌钙蛋白I(cTnI)检测看来决不会被标准化的争论。这不是说,我不希望出现标准化,但我想从科学的、以循证为基础的事实,说说这个心肌特定蛋白。我会考虑以下的分析, 我是一个热切的运动员。在六月的第二周,我每天早晨沿着河边跑步10公里。虽然,我每天跨越的的路是相同的,但每天早晨7点钟我观察到的是极其不同的。我被温度、风、伴随着闪电和打雷的下雨、在岩石裂缝里的水坑、覆盖的道路的树的枝条、以及因一个狐狸和两个黑熊出现在路上向上或向下走着等等。这个表现对cTnI的事情必须去考虑什么?

cTnI,是一个110个氨基酸残基的蛋白,具有一致的N-端序列,差异在于它来自骨骼肌形式,是心脏内肌原纤维的3个亚复合物(cTnI-CTnC-cTnT)的部分,具有特定的结构和调控功能(1)。因急性心肌梗死(MI)使细胞死亡后不久,cTnI从受伤的心肌中释放进入细胞外,在指示事件症状后的1~6小时,可在循环血液中检出cTnI(2)。数据说明,cTnI的循环主要与cTnC呈双复合物出现在急性MI的患者血液中,但也在血液中发现呈游离cTnI和三重复合物cTnICT。另外,有报道,游离的和复合的cTnI出现了C-和N-端蛋白水解的降解、氧化、和还原形式,以及磷酸化形式(3)。

使用抗-cTnI的单克隆抗体的免疫检测,对于每个检测方法取决于使用的抗体,识别决定簇区域。在cTnI分子内的蛋白区域,很容易被上述提及的修饰了—以及依赖决定簇的肝素的异变性质(4)、异嗜性抗体(5)、和自身抗体(6)的结合– 看来抑制了异变的免疫反应性,和甚至在某些情况下丧失反应性。免疫反应性的这样变异会导致在夹心法的cTnI免疫测定方法(使用捕获和检测抗体直接抗这些修饰区域)改变信号的产生。在早期MI后阶段,急性连续释放cTnI;同时在心肌组织和血液内进行着cTnI的修饰;又存在着对多种cTnI异构体不同清除基质和清除速率;所有上述在MI后的第一个24小时内累积一起,使没有2个患者的血液样品看来含有相同的cTnI异构体组成(7)。

另外,还有的实际问题,如溶血和温度的分析前影响,已经知道不同地影响检测。再有,高灵敏的检测已经开始改善了我们对健康个体内可检测的cTnI浓度的临床含义的理解(8),关于cTnI异构体的分布是否在人与人间一样,或是否在健康个体内它们保持着一样,我们还没有任何证据。例如,一些高灵敏的检测展示了在性别间有差异,有的没有差异。Wu等的早期研究,首先展示了市售检测试剂盒,对于依据cTnI多个复合物形式不同响应为基础的给定cTnI浓度产生了不同的相对响应(9)。这些资料说明,去比较不同厂商检测试剂盒得到的绝对浓度是不可能的。

cTnI的标准化不像确定和最佳的一级或二级参考物质那样简单。IFCC的心肌肌钙蛋白I标准化工作组的目标,看来被加倍了(10):首先,形成以血清为基础的二级参考物质,通过参考检测程序为之定值;第二,依据长期校准溯源性,通过参考检测程序为该物质设定cTnI校准值。虽然,我称赞工作组的努力,并认为这些研究将会报告多篇发表的报告;但以下的争论建议工作组将看来达不到他们的目标。

实现真正的cTnI免疫测定标准化,统一采用抗体、包括捕获和检测/信号抗体二者的标准化,并适合所有厂商,这是要求的第一步。该目标看来实现不了。另外,即使相同抗体被用于相同厂商的不同平台(仪器),观察到这些不同平台的结果不协同的窘态(Dade Behring/Siemens 和Beckman Coulter市场上的cTnI检测看到的)。第二,需要制备一级校准/参考物质,以可接受的质谱分析方法学去确认这样物质的定值,建立短期和长期的稳定性。

尽管NIST成功地与AACC委员会合作,产生了SRM 2921,这是天然的cTnICT的三重复合物,由HyTest产生的,这个物质减少了13个检测产品间的检测变异>40倍,到最好的,为2~3倍,并提供了亚最佳的一致性(11)。以SRM 2921物质为校准品,可使检测间有了一些溯源性,但是,从来没有可以让检测厂商要求使用这个物质。工作组一些成员的近期观察,通过免疫沉淀方法与荧光蛋白质印迹分析(Western blot)结合,与抗-cTnI单克隆抗体一起,说明NIST SRM 2921 cTnI物质在降解(12)。

正如这些作者说的,“这个发现进一步证实了在混合的阳性病人血清中cTnI的复杂性,如果降解开始就存在于患者样品、或发生于样品处理过程和储存时,则必须研究(12)。

工作组也叙述了依据多元小球为基础的免疫测定方法和SDS-PAGE的候选参考程序,声明可等摩尔检测游离cTnI、cTnIC双元复合物、磷酸化的和去磷酸化的游离cTnI、以及三重cTnICT复合物,不论有无肝素(13)。这些发现在使用HyTest的单克隆抗体(克隆560,可识别在氨基酸残基83~93的决定簇,和克隆19C7,可识别残基41~49的决定簇),在对于SRM2921标准化后被预示了。正如上述,但是,SRM 2921是出现了不同程度降解的趋势—这是工作组探索标准化中,没有被强调的一个重要事实。工作组报告了50 pg/ml的较低线性限值,较低的校准设定点为100 pg/ml,该浓度不适合用于高灵敏的cTnI检测(14,15),高灵敏试剂盒可检出浓度<1 pg/ml,将很快用于临床实践。

结论是,我归到(于)我的看法。在我沿着相同的河流路线持续的早锻炼时,让我天天看到的各种表现从来不一样。同样,由于每个患者样品cTnI异构体自然的混合物,对相同患者血液使用不同的cTnI检测方法进行检测,将是不同的结果,所以,对于检测方法间cTnI浓度间的可比性,减少了我们近期和我们未来的信心。作为一个老年运动员,我的每天锻炼的差异没有令我烦恼,我却很愉快,因为我还能每个早晨去锻炼。实验室人员和临床医生,一样,应不要被cTnI标准化陷入困境。而是,他们应对选择的检测在临床和分析证据有明确理解,应为技术改善而高兴,因为可对较低的cTnI浓度有了精密的检出,也将导致较好的病人护理。

参考文献(略)

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