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临床基因扩增=PCR?你太小看基因扩增了!

2018-06-20  来源:艾兰博曼医学网    编辑:hangminzheng
导读
目前,DNA或RNA扩增检测技术主要可分为以下三大类: 靶基因扩增:PCR,聚合酶链式反应;TAS,转录依赖的扩增;LCR,连接酶链式反应。 探针扩增:Qβ复制酶系统 信号扩增 放大:bDNA
PCR实验室平面图

临床基因扩增实验只有PCR?临床基因扩增实验室只做PCR实验?你未免也太小看它了。
根据《管理办法》,临床基因扩增检验是指通过扩增检测特定的DNA或RNA,进行疾病争端、治疗检测、预后判定和用药指导等。
所以,虽然我们常吧临床基因扩增实验室称为PCR实验室,但是临床基因扩增≠PCR哦!它涵盖了更丰富的内容。
 
目前,DNA或RNA扩增检测技术主要可分为以下三大类
靶基因扩增:PCR,聚合酶链式反应;TAS,转录依赖的扩增;LCR,连接酶链式反应
探针扩增:Qβ复制酶系统
信号扩增/放大:bDNA
 
PCR
介绍:利用一段DNA为模板,在DNA聚合酶和核苷酸底物共同参与下,将该段DNA扩增至足够数量,以便进行结构和功能分析。PCR检测方法在临床上快速诊断细菌性传染病等方面具有极为重要的意义。
常见项目:乙型HBV-DNA定量、人乳头瘤病毒(6,11型)(HPV6,11)核酸定量
 
TAS
介绍:主要用于扩增RNA。扩增样本中的RNA,一般要先将其逆转录成cDNA,再以cDNA为模板进行PCR扩增,能否将RNA靶序列直接扩增出来呢?Kwok等人发明了TAS来解决这一问题。结合应用葡聚糖珠寡核苷酸杂交技术可进一步提高方法的特异性和效率。其原理是:制备引物A、B,引物A与待检RNA3’端互补,并有一T7RNA多聚酶的识别结合位点。逆转录酶以A为起点合成cDNA;引物B与此cDNA3’端互补,逆转录酶同时还具有RnaseH和DNA多聚酶的活性,又可利用引物B合成cDNA的第二链。RNA多聚酶以此双链cDNA为模板转录出与待检RN-一样的RNA,这些RNA又进入下轮循环。RNA多聚酶从一个模板可以转录出10~103个拷贝,因此反应中待检RNA拷贝数以10的指数方式增加,较PCR高得多。扩增产物用葡聚糖珠夹心杂交法检测:产物先与标记的探针杂交,再与包被在葡聚糖珠上的另一互补寡核苷酸(与标记探针互补的位置不同)杂交、检测。该方法同一般杂交检测技术相比,特异性要高出许多。
TAS主要特点是扩增效率极高,由于拷贝数是以10指数递增,只有6个循环,靶序列即能达到2×106个拷贝。由此而来的另一个特点是特异性很高,在一般的RNa PCR扩增中,由于逆转录酶和Taq多聚酶均无较对活性,要发生错掺,循环次数越多,错掺率越高。TAS仅需循环4~6次,将错掺率降低了4/5。用葡聚糖珠夹心杂交法,又进一步提高了特异性。目前认为TAS是扩增RNA的首选方法。
 
LCR
介绍:在连接酶扩增反应或连接酶检测反应的基础上,引入热稳定的连接酶而建立的类似PCR 技术的新方法。LCR 既可扩增,又可鉴定D N A 异常,与PCR 技术一样可用于已知病因的遗传病大面积普查。LCR的扩增效率与PCR相当。由于有很高的信噪比,其敏感性也很高。用Taq连接酶做LCR只在两个保温点的循环(94℃、1min和65℃、4min)。产物检测也非常方便、敏感。因此可以说LCR是目前检测已知序列中有无点突变的最佳方法。
常见应用:淋球菌、沙眼衣原体等性传播疾病病原体的实验室检测
 
探针扩增:Qβ复制酶系统
Qβ复制酶(Q-beta replicase)具有催化RNA模板的自我复制的功能,能在常温30min,将其天然模板MDV-1RNA扩增至109。1986年Chu等报道 用生物标记的靶序列特异性探针,可与亲和素联接的MDV-1RNA杂交,经洗脱未被结合 的MDV-1后,再加入Qβ复制酶,扩增复制MDV-1拷贝,然后用溴乙锭染色检测或用同 源性的第二探针杂交。1988年Lizardi等,将靶基因序列插进MDV-1质粒里,用T7 RNA聚合酶催化转录 出MDV-1 RNA探针,这种RNA探针可与靶序列杂交,然后洗去非杂交的探针,加入Qβ 复制酶来扩增探针,被扩增的探针又可作为模板进行扩增,并呈指数递增。其产物 按上述两种方法进行检测。现在该技术又发展了夹心杂交法,分子开关和靶依赖的复 制等技术。
 
信号扩增/放大:bDNA
介绍:一种不依赖PCR扩增的核酸杂交信号放大检测技术,该技术克服了传统的real time PCR技术中的缺陷与不确定因素,无需抽提纯化RNA,无需反转录,无需PCR扩增,只要将样本用特定裂解液裂解后,经探针杂交与信号放大后即可迅速得到基因定量结果。目前bDNA 技术已发展至第三代,技术不断优化,与电化学技术、纳米技术等的结合更扩展了该技术的发展前景,bDNA 技术目前不仅用于病毒DNA或RNA的检测,也可用于检测细胞内基因的表达水平,在临床检测和科研工作中应用越来越广泛。
产品:宫颈稳态检测试剂盒

所以,大家以后可不要再小看临床基因扩增了哦。除了PCR实验之外,基因扩增实验室还有更加广阔的应用,基因扩增也有更加多样化的发展。
当然这一切,都需要大家掌握最基础的PCR操作原理和技能。
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